style="width:4.57997in;height:4.5133in" />GB/T 34059—2017 本文是学习GB-T 34059-2017 纳米技术 纳米生物效应代谢组学方法 核磁共振波谱法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了纳米材料暴露引起生物体代谢组变化的核磁共振检测方法。
本标准适用于纳米材料的生物效应评价。
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件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 13966 分析仪器术语
GB/T 19619 纳米材料术语
GB/T 13966 和 GB/T 19619界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1
代谢组学方法 metabonomics;metabolomics
对生物体内代谢物组进行分析，并建立代谢物与生理病理变化的对应关系的组学方法
。
3.2
纳米材料暴露 nanomaterials exposure
纳米材料与人群或实验细胞和动物充分接触。
见附录 A。
用质子 NMR
法检测经纳米材料暴露后的生物样本，利用多变量统计分析代谢组学方法分析代谢
物含量的变化，据此评估纳米材料生物效应。
质子共振频率500 MHz 以上的NMR 谱仪，参数优化建议参见附录 B。
GB/T 34059—2017
用于 NMR 谱仪检测的样品管。
纳米材料暴露后的生物样本，包括细胞、动物体液和组织等。
8.1 打开仪器，将装有待测试样的样品管置于 NMR 磁体内。
8.2 设置待测样本温度(通常实验温度为25℃),等待至仪器稳定。
8.4 调用仪器自带氢谱脉冲序列，根据不同生物样本选择合适的脉冲序列。
8.5 参照仪器厂家提供的标准物质的谱峰半高宽，对 NMR 谱仪进行匀场。
8.6
优化并设定谱宽、脉宽、等待时间、采样点数、采样时间和扫描次数等测量参数。
8.8 将仪器所测谱图保存，并记录仪器状态和测量数据。
8.9 选取部分代表性样品进行二维 NMR 谱的采集并保存。
代谢物的 NMR
信号通过一系列二维谱进行归属，并查阅相关文献和公共数据库进行归属验证。
通常情况下，NMR
信号包括糖类、氨基酸类、胆碱类、有机羧酸类、脂肪酸、核苷/酸类等代谢物。
应用核磁谱仪自带分析软件将核磁信号进行预处理，包括核磁谱图基线的校正、化学位移的定标、
谱峰对齐和积分以及数据归一化。对于细胞培养液和尿样宜采用总面积归一化；对于血浆样品宜采用
不归一化或总面积归一化；对于细胞提取物、组织提取物和肠道提取物宜采用湿重归一化；对于肠道内
容物提取和粪样提取宜采用干重归一化。
应用生物信息学软件将核磁数据进行标准化预处理，包括中心化处理、自适换算、帕累托换算等。
主成分分析宜选择中心化处理方式。正交化偏最小二乘法判别分析宜选择自适换算或者帕累托换算。
10.3.1 概述
包括非监督的模式识别方法和有监督的模式识别方法。
10.3.2 非监督的模式识别方法
将数据进行主成分分析(PCA)。
主成分分析可以直观展示样品的聚集离散程度、是否存在异常点
GB/T 34059—2017
和组内分组趋势。
10.3.3 有监督的模式识别方法
将数据进行正交化偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA), 并将 OPLS-DA
标准化处理后的数据进行
回溯转换成负载图。
10.4.1 概述
主要包括内部验证和外部验证，确保后续数据分析结果的可靠性。
10.4.2 内部验证
主要采用交叉验证的方法。舍一法是最常用的一种交叉验证方法，即将样本总数的1/7作为验证
集，6/7作为训练集。
10.4.3 外部验证
主要包括置换排列检验(Permutation Test)和变异系数方差分析(CV-ANOVA)
两种方法。
11.1
金纳米棒体外暴露的代谢组学测试，形态学与组织病理学辅助评价及常规生化指标检测等生物
效应评价实例参见附录 B。
11.2 纳米材料生物效应研究的核磁共振检测报告格式参见附录 C。
GB/T 34059—2017
(规范性附录)
缩 略 语
缩略语见表 A.1。
表 A.1 缩略语
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style="width:4.57997in;height:4.5133in" />GB/T 34059—2017
(资料性附录)
金纳米棒对细胞毒性评价实例
B.1 金纳米棒表征
采用透射电子显微镜和紫外/可见吸收光谱仪分别表征了十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)
修饰的
金纳米棒的形貌(16.7 nm×62.5 nm)和消光光谱特性，如图 B.1 所示。
style="width:5.70003in;height:4.23984in" />
波长/nm
图 B.1
透射电子显微镜(左)与紫外/可见吸收光谱仪(右)对金纳米棒的特性表征
B.2 纳米材料体外(细胞)暴露实验步骤
B.2.1 细胞培养
本实例采用含10%胎牛血清 DMEM 培养基(不含 HEPES,
不加抗生素),接种密度40%～50%,
温度为37℃,二氧化碳5%,培养48 h,使细胞融合度接近100%。
B.2.2 纳米材料暴露
细胞培养融合度接近100%时，开始加入纳米材料溶液进行暴露实验，同时保留一组细胞样本作为
平行对照组。实验过程中使用显微镜观察细胞生长情况并进行细胞计数，建议用于代谢组学分析的细
胞个数约为10°个，湿重约为100 mg。 金纳米棒暴露24 h
后，将细胞计数并收集。
B.2.3 细胞收集
首先用移液器移去培养基，加入5 mL 磷酸缓冲液(PBS) 润洗，然后移除 PBS,
加入0 . 25%胰酶 5mL 消化细胞约2 min～5 min。
向细胞培养液中加入含血清培养基4 mL 使胰酶失活，将溶液转至
15mL 离心管。加入4 mL
培养基再次润洗培养瓶，将溶液转至同一离心管。然后在温度为4℃,转速
为800g 情况下离心2 min, 除去上清液；加入4℃预冷的 PBS3mL
将培养皿冲洗3次，转速为800g
情况下离心后除去上清液，收集细胞，准确称重后保存于一80℃超低温冰箱。
style="width:4.89999in;height:3.0932in" />
style="width:4.92658in;height:3.14006in" />GB/T 34059—2017
B.2.4 细胞代谢物提取步骤
提取步骤包括：
a) 往细胞中加入体积比为1:2水/甲醇1 mL
混合溶液，混匀，采用液氮和37℃水浴分别冻融
b) 在冰浴条件下采用250 W 超声破碎细胞15 min,超声方式为：超声1 min,暂
停 1 min, 如此循 环 8 次 ；
c) 在4℃,转速为3200g 条件下离心10 min
后收集上清液；在细胞残渣中加入体积比1:2水/ 甲 醇 1 mL
混合溶液，混匀，采用液氮和37℃水浴分别冻融3次；
d) 在冰浴条件下采用250 W 超声破碎细胞15 min,超声方式为：超声1 min,暂
停 1 min, 如此循 环 8 次 ；
e) 将上述2次收集的上清液汇入5 mL EP 管，在4℃,转速为3200g 离心10 min
后收集上 清液；
f) 采用真空浓缩仪除去甲醇，冷冻干燥除水，保存于一80℃超低温冰箱。
B.3 纳米材料暴露前后的细胞形态学表征
如图 B.2所示，16HBE 细胞和A549 细胞在金纳米棒暴露48 h
后的荧光成像对细胞存活率。
style="width:4.97361in;height:7.09444in" />
说明：
绿色——活细胞；
红色——死亡细胞(箭头所示)。
图 B.2 16HBE 细胞(A) 与 A549 细胞对照组(B)
分别在 CTAB 表面修饰金纳米棒
暴露48 h(C,D) 后细胞的明场与荧光成像图
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B.4
常规生化指标检测
根据实验对象，合理检测生化指标。本实例中，纳米材料暴露后导致细胞氧化应激损伤，而谷胱甘
肽(GSH) 与氧化型谷胱甘肽(GSSG), 或 GSH/GSSG
的比值是氧化应激的生物标志物，因此采用生化
方法或者核磁共振检测细胞内 GSH/GSSG 的比值及三磷酸腺苷(ATP) 含量(图
B.3)。
style="width:5.43996in;height:3.89334in" />
style="width:5.25336in;height:3.86576in" />
style="width:5.37985in;height:4.03326in" />
A549 cells
style="width:5.27995in;height:3.99344in" />
16[[BE cells
说明：
— — 有 显 著 性 意 义 的p 值小于0.05;
** -—有显著性意义的p 值小于0.01;
*** — 有显著性意义的p 值小于0.001。
图 B.3 CTAB 表面修饰金纳米棒暴露对 A549
细胞和16HBE 细胞内不同暴露时间 GSH 与
GSSG 的比值及 ATP 含量的影响
B.5 细胞提取液代谢物 NMR 检测
本实例中，细胞提取物使用一维的具有预饱和水峰照射的 NOESY
验参数优化见表 B.1。
脉冲序列采集'H NMR 谱。实
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表 B.1 实验参数的优化
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20 ppm |
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2 s |
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100 ms |
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3 μs |
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1.36 s |
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细胞提取物 NMR 信号检测并进行归属(图 B.4)。
style="width:10.50656in;height:5.8135in" />
化学位移/ppm
说明：
1——脂肪；
2——亮氨酸；
3——异亮氨酸；
4——缬氨酸；
5——乳酸。
图 B.4 细胞提取物 NMR 谱图及部分信号归属
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B.6 NMR 信号预处理后的多变量统计分析
B.6.1 主成分分析(非监督分析)
图 B.5
主成分分析得分图显示金纳米棒导致不同细胞代谢组存在明显的分离趋势，并且数据集无
异常点存在。
style="width:2.65327in;height:2.8534in" />
-0.020.000,02
主成分1
style="width:2.64666in;height:3.08682in" />
主成分1
图 B.5 对照组(红色圆圈)与 CTAB
表面修饰金纳米棒暴露48 h(黑色方框)时
16HBE(A) 和 A549(B) 主成分分析得分图
B.6.2 偏最小二乘法判别分析(有监督分析)
如图B.6 所示为16HBE 细胞对照组与 CTAB 表面修饰金纳米棒暴露24 h
的细胞其提取物的 OPLS-DA 得分图与其相关系数负载图。图形横坐标为 NMR
谱的化学位移，纵坐标为每个变量相关系 数的绝对值(Irl),
图形用不同颜色来表征代谢物对区分组间的贡献大小。颜色越红，则变量和分组变
量的相关系数(r)
越大，表示该代谢物对区分组间的贡献越大；反之，颜色越蓝，r
越小，则表示变量对区
分组间的贡献越小。此外，通过皮尔森相关系数显著性差异检测 (Pearson's
product-moment correlation coefficient),并综合考虑组内样本数 n
(最少组的样本数),确定评估代谢物变化是否达到具
有统计学差异的阈值(p≤0.05)。 例如当n=10 时，其相关系数的阈值
rcuoft为0.602,即当代谢物信号
的相关系数绝对值 \|rl≥0.602 时，则代谢物的变化才具有统计学差异。
style="width:12.07329in;height:2.70666in" />
化学位移/ppm
图 B.6 A549 细胞对照组与CTAB
表面修饰金纳米棒暴露48 h 的细胞其提取物的
OPLS-DA 得分图(左)与其相关系数负载图(右)
B.6.3 多变量分析模型验证
置换排列实验结果显示16HBE 细胞(A) 和 A549 细胞(B) 对 CTAB
表面修饰金纳米棒暴露48 h
style="width:3.90674in;height:2.39998in" />GB/T 34059—2017
时所建立的数学模型较好(图 B.7)。 其中绿色数据点代表排列实验中的R²
值，蓝色数据点代表排列实 验中的Q² 值，任何一次随机排列产生的R²、Q²
值均小于右端的原始值，表明原始模型的预测能力大于
任何一次随机排列变量的预测能力，则该模型验证通过。
style="width:3.91319in;height:2.4134in" />
说明：
纵坐标 ——模型预测能力值；
横坐标 — 排列实验随机率；
绿色数据点——R² 值；
蓝色数据点——Q² 值。
图 B.7 16HBE 细胞(A) 和 A549 细胞(B)
对 CTAB 表面修饰金纳米棒暴露48 h 时
模型的置换排列实验
另外，OPLS-DA 模型的 CV-ANOVA 验证显示16HBE 细 胞(A) 和 A549 细 胞(B)
对 CTAB 表 面
修饰金纳米棒暴露48 h 时 的p
值为1.69×10-³,远小于0.05,表明所建立的数学模型较好。
B.7 测试结果和金纳米棒细胞生物效应评价
NMR
检测并归属了包括亮氨酸、异亮氨酸、乳酸等代谢物；多变量统计分析发现金纳米棒暴露于
正常细胞(16HBE)
导致谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸含量显著升高，还原型谷胱甘肽含量显著下降，氧化
型谷胱甘肽含量显著升高；然而，金纳米棒暴露于癌细胞(A549)
后，细胞内谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸
含量未见显著变化，还原型谷胱甘肽含量显著下降，大量的核苷酸含量显著下降。荧光成像对细胞存活
率的表征表明金纳米棒暴露于正常细胞(16HBE)
显示细胞毒性较小，而暴露于癌细胞(A549) 后显示明
显的细胞毒性。
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(资料性附录)
纳米生物效应研究 NMR 检测报告格式
纳米生物效应 NMR 检测报告
报告编号：
名称： 地址：
联系方式：
名称： 编号：
3 测试依据：
制造单位： 型号：
待测样品类型： 温度： 脉冲序列名称：
采样时间： 等待时间： 谱宽：
90度脉宽： 扫描次数： 采样点数：
原始谱图： 信号归属： 多变量统计分析方法： 模型验证方法：
显著性变化的代谢物：
有显著性变化代谢物的相关系数值：
测试人员： 测试日期：
机构名称： 地址：
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